Nyitólap Aktuális Patent
 Szelence
BIOTEOMED.ORG



Zika vírus        2018-2                                        
KUTATÁS, PREKLINIKA

Nukleinsav alapú diagnosztika

Hét brazil tagállam 15 laboratóriumának bevonásával végzett külső minőségellenőrző körvizsgálat (2017) a Zika fertőzés (ZIKV) laboratóriumi kimutatására szolgáló molekuláris (nukleinsav alapú) diagnosztikai teszt érzékenységének és specificitásának összehasonlító értékelésére.

Fischer C. et al. (+26) (2018): External Quality Assessment for Zika Virus Molecular Diagnostic Testing, Brazil      Emerg Infect Dis. 24: 888–892.  PMID: 29470164

A körvizsgálatba bevont laboratóriumok földrajzi elhelyezkedése (kb. 2500 km mentén) lehetőséget nyújtott a járványban kevésbé érintett területeken, valamint a járvány forrpontját jelentő északkeleti területeken végzett ZIKV diagnosztika összehasonlító elemzésére.

A körvizsgálatban részt vettek: egyetemi és közkórházi laboratóriumok, szövetségi közegészségügyi intézmények és egy diagnosztikai cég.
A körvizsgálatban alkalmazott panelek: 12 liofilizált minta/panel/vizsgálóhely, azaz arbovírus-negatív human plazmába inokulált hőinaktivált teljes vírus (vírusfertőzött sejttenyészet felülúszó, ld. alábbiak) + kontroll.
A minták tartalma:
» 4 minta a vírusterhelés, az érzékenység meghatározásához: 103–106 ZIKV-RNS kópia/ml. Vegyes összetétel: Zika-Ázsia és Zika-Amerika (strain MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015) + Zika-Afrika (strain MR766).
» 7 ZIKV negatív heterológ minta a specificitás meghatározásához: Dengue 2 és 4 szerotípus (DENV 2,4), Japán encephalitis vírus (JEV), St.Louis enecephalitis vírus (SLEV), West Nile vírus (WNV), Sárgaláz vírus (YFV), Chikungunya vírus (CHIKV)  ≈105 vírus /ml  (in vitro szövettenyészet  ≈50% fertőzését eredményező dózis).

» 1 negatív plazma minta.

» WHO standard* a ZIKV mennyiségi meghatározásához.

*Helyette: biohazard kockázatok és megszorítások, logisztikai és költség gondok elkerülésére, RT-PCR szekvencia tapasztalatok alapján szintetikus Zika RNS (pszeudovírus) előállítása bakteriofág fehérjébe csomagoltan. Előnyei: stabil, nem fertőző, általános kontroll és költséghatékony.
A Zika terhelés mennyiségi meghatározásakor a WHO Zika standarddal és a szintetikus Zika RNS kontrollal kapott eredmények nem mutattak szignifikáns eltérést.

» A laboratóriumok diagnosztikai eredményeit összehasonlító értékelés alapja: 14/15 laboratórium ugyanazt a real-time RT-PCR (rRT-PCR) protokollt alkalmazta.
Lanciotti R.S. et al. (2008): Genetic and Serologic Properties of Zika Virus Associated with an Epidemic, Yap State, Micronesia, 2007   Emerg Infect Dis. 14: 1232–1239.

 Tapasztalatok
  • 4/15 laboratóriumban (27%) valamennyi mintával korrekt eredményeket értek el.
  • 5/15 laboratóriumban (33%) az alacsony ZIKV koncentrációt tartalmazó mintáknál hamis negatív eredményeket kaptak. 
  • Csak két mintánál, a két legnagyobb ZIKV koncentrációnál (8.1 × 105  és  7.0 × 103 ZIKV-RNS kópia/ml) sikerült valamennyi laboratóriumban egységesen korrekt eredményt elérni.  
  • Fentiek megkérdőjelezik a rRT-PCR teszt érzékenységét, hiszen akut fertőzésben gyakori a 103 - 104 kópia/ml víruskoncentráció (vér, vizelet, nyál).
  • 6/15 laboratóriumban ZIKV-negatív mintákra hamis pozitív eredményt kaptak. (A hamis pozitív eredmény pl. terhességmegszakításokhoz is vezethet, hiszen a Zika fertőzés és a torzult magzati neurogenezis között az összefüggés tisztázott).  A 6/15 hamis pozitív eredmény nem társult heterológ Flavivírus fertőzéssel (» oligonukleotid aspecifikus kötődés kizárása). Laboratóriumi kontamináció lehetősége?  
  • 7/15 laboratóriumban manuális RNS extrakció történt; össz-teljesítményüket felülmúlta a további 8/15 laboratórium, ahol az RNS extrakció is automatizáltan történt. 
  • Összegzés: az eddig ismert hiányosságokkal együtt, ZIKV diagnosztikában a genetikai és a szerológiai tesztek kombinált alkalmazása továbbra is nélkülözhetetlen.  
  • ?? Kérdőjelek ?? Tekintettel ZIKV globális elterjedésére, a potenciális járványveszélyre, fejlesztési cél az egységes és megbízható ZIKV diagnosztika. Akadály: a ZIKV járványokkal leginkább sújtott területeken (pl. régiók Latin-Amerikában, Afrikában, Ázsiában) forráshiány akadályozza a költséges (vám, disztributor margin) rRT-PCR reagensek beszerzését. Mindezzel együtt, jelen diagnosztikai tanulmány sugalmazza a külső minőségellenőrző körvizsgálat rendszeres ismétlését és kiterjesztését valamennyi kontinensre.



▓░▓▒▓░▓▒▓░▓▒▓░▓▒▓░▓░▓▒▓░▓▒▓░▓▒▓░▓▒▓░▓░▓▒▓░▓▒▓░▓▒▓


Szerodiagnosztika

Fejlesztési cél a Flaviviridae család többi tagjától elkülönítő ZIKV differenciál-diagnosztika.
Ismeretes, hogy fertőzött gazdaszervezetben a Flaviviridae családtagok (mint például ZIKV, DENV...) által generált IgM és neutralizáló ellenanyagok elsődleges támadáspontja a virion felszíni 'E' ('env') glikoprotein antigén, amelynek szekvenciája és térszerkezete a különböző flavivírusokban nagyfokú hasonlóságot mutat. A hasonlóság következményeként fellépő szerológiai keresztreakciók miatt a jelenlegi ZIKV szerodiagnosztika eredményes lehet mindazon földrajzi területeken, ahol más flavivírus még nem jelent meg. Ez utóbbi azonban irreális feltételezés, hiszen a biogeográfiai szóródás a ZIKV-t egyre inkább besodorja a további flavivírus családtagok (pl. Dengue, Kullancs encephalitis, Sárgaláz...) terjedési zónáiba.

Fentiek ismeretében Gao X. és munkatársai a ZIKV differenciál-szerodiagnosztikát a vírus nem-szerkezeti fehérje alkotójának (non-structural protein 1 = NS1) 2017-ben közölt antigenitására alapozta, hangsúlyozva egyúttal a ZIKV-NS1 diagnosztika addig ismeretlen kinetikai vonatkozásait.
   
Gao X. et al. (2018):  Delayed and highly specific antibody response to nonstructural protein 1 (NS1) revealed during natural human ZIKV infection by NS1-based capture ELISA

Az általuk kidolgozott IgG capture ELISA eljárásban emlős 293T sejtvonalban (HEK293T - human embrionális veséből származó transzformált sejtvonal) expresszált rekombináns ZIKV-NS1 (teljes fehérjelánc) antigén segítségével követéses vizsgálatba vonták azt a két kínai utazót, akik Latin-Amerikából ZIKV-fertőzéssel tértek vissza.  
       
A munka során:
*  ZIKV-NS1 és Dengue(1-4)-NS1 teljes fehérjelánc      előállítása emlős 293T sejtekben,
*  utazóktól vérminták a vírusfertőzés tüneteinek megjelenését követő idő  függvényében,
*  mind a négy Dengue szerotípusra a szerológiai  keresztreakciók ellenőrzése,
*   vérmintákból ZIKV-NS1 monoklonális ellenanyagok   izolálása,
* ZIKV-NS1 kötődés vizsgálata DENV-1 vírusfertőzött  populáció szérum mintáiban.


Tapasztalatok
  • Utazó-1-től vett nyolc szérum minta (4-7-15-32-65-106-188-322. nap a tünetek megjelenése után) és Utazó-2-től vett három szérum minta (6-12-66. nap a tünetek megjelenése után) a vizsgált 1:100 és 1:1000 higításokban igazolta, hogy az anti-NS1 ellenanyag megjelenésének ideje, csúcskoncentrációjának elérése a poliklonális anti-E ellenanyaghoz képest jelentős késést mutat.
  • Utazó-1 és Utazó-2 memória B sejtek in vitro >>> öt monoklonális ellenanyag (mEA) izolálása és jellemzése: 4/5 mEA erősen kötődött ZIKV-NS1 antigénhez, és nem reagált Dengue[DENV(1-4)]-NS1 antigénekkel. 1/5 mEA adott keresztreakciót DENV2-NS1 és DENV4-NS1 antigénekkel, ám ZIKV-NS1 antigénhez képest jóval enyhébb reakcióval (részleges szekvencia és szerkezeti hasonlóság). 
  • 108 DENV1-fertőzött egyedből szérum minták a fertőzés (35 primer, 20 szekunder, 53 ismeretlen fázisú fertőzés) utáni lábadozó szakaszból > 1:100 higításban ELISA teszt ZIKV-NS1 és DENV(1-4)NS1 kötésre >>> 106/108 esetben ZIKV-NS1 antigénnel nem tapasztalható keresztreakció. 2/108 esetben a DENV1 immunszérum a DENV(2-3-4) antigéneken kívül a ZIKV-NS1 antigénnel is reagált. 
  • Összegezve: DENV 'E' és ZIKV 'E' antigént célzó szerológiai keresztreakciók miatt a ZIKV differenciál-diagnosztikában előnyösebb stratégia az NS1 antigént célzó megoldás.
  • ??  Kérdőjelek ??  A ZIKV diagnosztikai reagensek beszerzését beárnyékoló regionális forráshiányok, továbbá, a jelenlegi diagnosztikai eljárások (nukleinsav alapú + szerodiagnosztika) laboratóriumi kötődése nem tűnik könnyen hozzáférhető és gazdaságos megoldásnak a nagy mintaszámmal dolgozó, helyszíni (POC / Point of Care) diagnosztika megvalósításában. 
  • Draz M.S. és munkatársai az említett hiányosságok áthidalására dolgozták ki módszerüket, miszerint cellulóz microchipre telepített elektródák jelenlétében ZIKV-fertőzött vizsgálati mintákban platina-nanorészecskék segítségével az elektromos vezetőképesség változása követhető. Draz M.S. et al. (2018): Nanoparticle-enhanced electrical detection of Zika virus on paper microchips  Nanoscale. 10(25):11841-11849. doi: 10.1039/c8nr01646a.                                                                              
  • A módszer lényege: vírus-specifikus ellenanyaggal konjugált mágnes gyöngyök segítségével biológiai mintából vírusizolálás ("vírushalászat"), az izolátum jelölése elektromos jeladásra képes platina-nanorészecskékkel (PtNP), a jelölt víruskomplexek felvitele cellulóz-és-műanyag (0,18mm-és-0,1mm vastag) alapú, mikroelektródákkal ellátott microchipre, a jelölt víruskomplexek mosása alacsony vezetőképességű oldattal majd detergenssel, amely utóbbi a töltéses molekulákat és a PtNP részecskéket kiszabadítja a víruskomplexből. Mindezek eredményeként az oldat vezetőképessége megváltozik, ami impedancia-spektroszkópiával követhető.                                                                        
  • Eddigi eredmények: rokon flavivírussal (DENV-1 és DENV-2) nem interferáló, nagy specificitású ZIKV-detektálás, ahol a kimutatás alsó határa (LOD) = 101 vírusrészecske/μl.
Figyelemre méltó: a ZIKV-NS1 szerológiai célpont diagnosztikai eredményességét sugallja az a korábbi vizsgálatsor, amelyben ZIKV-endémiás területekről visszatért belga (9 minta), cseh (38 minta), német (6 minta), olasz (13 minta), izraeli (33 minta) és chilei (6 minta) utazókat vontak be követéses szerodiagnosztikai vizsgálatokba. Szerzők a fertőzés tüneteinek megjelenését követően eltelt idő függvényében az IgM és IgG kimutatás során eltérő diagnosztikai érzékenységet tapasztaltak, következésképpen hangsúlyozzák a ZIKV-NS1-specifikus IgM és IgG ellenanyagok együttes (multiplex) kimutatásának jelentőségét. 
KLINIKAI  VIZSGÁLATOK
  (Előzmények:  Aktuális 2017/Zika vírus/...
                                    ... Zika vakcina konstrukciók...)



Tisztított inaktivált Zika vírus: hagyományos aktív immunizálás
1. NCT02963909 
2018-06-12. állapot: folyamatban
A Phase 1, First-in-human, Double-blinded, Randomized, Placebo-controlled Trial of a Zika Virus Purified Inactivated Vaccine (ZPIV) With Alum Adjuvant in Healthy Flavivirus-naive and Flavivirus-Primed Subjects
Kezdet: 2016. november 1.
Tervezett elsődleges befejezés: 2019. február 1.
Tervezett teljes befejezés: 2019. február 1.
Előzetes Közlemény > Modjarrad K. et al (+36) Lancet 391: 563-571. (2018)

2. NCT03008122
2018-06-12. állapot: toborzás
Phase I, Randomized, Double-blinded, Placebo-Controlled Dose De-escalation Study to Evaluate Safety and Immunogenicity of Alum Adjuvanted Zika Virus Purified Inactivated Vaccine (ZPIV) in Adults in a Flavivirus Endemic Area
Kezdet: 2017. február 24.
Tervezett elsődleges befejezés: 2019. július 18.
Tervezett teljes befejezés: 2020. január 15.

3. NCT02952833
2018-06-12. állapot: folyamatban
 ZIKA Vaccine in Naive Subjects
(Phase 1, Double-blinded, Placebo-Controlled Study of the Safety and Immunogenicity of Alum Adjuvanted Zika Virus Purified Inactivated Vaccine (ZPIV) Administered by the Intramuscular Route in Flavivirus Naďve Adult Subjects)
Kezdet: 2016. október 14.
Tervezett elsődleges befejezés: 2018. december 18.
Tervezett teljes befejezés: 2019. június 25.
Előzetes Közlemény > Modjarrad K. et al (+36) Lancet 391: 563-571. (2018)


Vírusfelszíni 'prM-E' vagy 'M-E' szerkezeti fehérjéket kódoló plazmid DNS vakcina
1. NCT02809443
2018-06-12. állapot: folyamatban
Study of GLS-5700 in Healthy Volunteers
Kezdet: 2016. július
Tervezett elsődleges befejezés: 2017. november
Tervezett teljes befejezés: 2017. december  
Előzetes Beszámoló > Tebas P. et al (2017): Safety and Immunogenicity of an
Anti–Zika Virus
DNA Vaccine
- Preliminary Report
DOI: 10.1056/NEJMoa1708120

2. NCT02887482 
2018-06-12. állapot: folyamatban
Study of GLS-5700 in Dengue Virus Seropositive Adults
Kezdet: 2016. augusztus
Tervezett elsődleges befejezés: 2017. október
Tervezett teljes befejezés: 2018. június
                                               Jelenleg nincs további információ.

3. NCT02840487
2018-06-12. állapot: folyamatban
Safety and Immunogenicity of a Zika Virus DNA Vaccine, VRC-ZKADNA085-00-VP, in Healthy Adults
Kezdet: 2016. augusztus 2.
Tervezett elsődleges befejezés: 2018. december 28.
Tervezett teljes befejezés: 2018. december 28.
Előzetes Közlemény > Gaudinski M.R. et al (+35) Lancet 391: 552-562.(2018)

4. NCT02996461
2018-06-12. állapot: folyamatban
VRC 320: A Phase I, Randomized Clinical Trial to Evaluate the Safety and Immunogenicity of a Zika Virus DNA Vaccine, VRC-ZKADNA090-00-VP, Administered Via Needle and Syringe or Needle-free Injector, PharmaJet, inHealthy Adults
Kezdet: 2016. december 16.
Tervezett elsődleges befejezés: 2018. december 28.
Tervezett teljes befejezés: 2018. december 28.
Előzetes Közlemény > Gaudinski M.R. et al (+35) Lancet 391: 552-562.(2018)

5. NCT03110770
2018-06-12. állapot: toborzás
VRC705: A Zika Virus DNA Vaccine in Healthy Adults and Adolescents (VRC-ZKADNA090-00-VP / Phase 2)
Kezdet: 2017. március 29.
Tervezett elsődleges befejezés: 2020. január
Tervezett teljes befejezés: 2020. január
Előzmények > Dowd K.A. et al (+30): Science 354: 237-240 (2016)


Vírusfelszíni szerkezeti fehérjéket kódoló messenger RNS (mRNS) vakcina
1. NCT03014089
2018-06-12. állapot: folyamatban
Safety, Tolerability, and Immunogenicity of mRNA-1325 in Healthy Adult Subjects
Kezdet: 2016. december
Tervezett elsődleges befejezés: 2018. szeptember
Tervezett teljes befejezés: 2018. szeptember

Forrás: ClinicalTrials.gov
               PubMed



Copyright© www.bioteomed.org
Compass
Kapcsolat: btm(kukac)bioteomed(pont)org
természet, tudomány, kutatás, fejlesztés, ipar, biológia, fizika, kémia, mezőgazdaság, medicina, gyógyszer, szabadalom, technológia, irodalom, művészet, oktatás